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人DNA甲基化捕获测序服务

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SureSelect 人甲基化测序系统(Human Methyl-Seq)是首个全面的NGS靶向序列捕获系统,将重亚硫酸盐处理方法和Illumina高通量测序平台相结合,进行全基因组甲基化捕获测序,对DNA进行先捕获后转化的技术策略。可帮助研究人员关注那些已知甲基化可影响基因调控的区域:CpG islands、CpG island shores、CpG island shelves、 undermethylated 区域、启动子、肿瘤及组织特异性甲基化区域 (DMR)、增强子、Ensemble 调控区域和DNase I 高敏感位点。






一、技术优势与应用方向


技术优势:

✴ 样本类型:细胞、全血、新鲜冷冻组织,石蜡FFPE

✴ 重复性高:实验重复性分析相关系数R2>0.97

✴ 高灵敏度:单碱基分辨率

✴ 可以检测相对比较多的位点,370万CpG位点

✴ 可进行甲基化单体型分析


应用方向:肿瘤方向研究、精神类疾病研究、复杂疾病研究、生长发育性研究、甲基化年龄研究等。






二、送样建议


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三、数据分析


甲基化捕获测序原始数据以fastq(fq)文件格式存储,对于下机的 FASTQ 数据需要进行质控,这里采用fastp和multiQC(版本:0.19.4),进行全方位质控,使用bismark(bismark版本: v0.19.0;bowtie2版本:2.3.4.2)进行甲基化基因组比对,使用qualimap/bedtools/samtools等工具对bam文件进行质量评估,统计测序数据的比对情况和靶标区域的捕获效率,使用methylkit(版本:v1.6.1)工具可以直接读取的基因组水平甲基化扫描文件,然后进行差异分析,研究内容包括差异甲基化位点DMS和差异甲基化区域DMR,并对甲基化区域DMR进行注释以及富集分析。


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生信分析流程






四、甲基化捕获测序结果展示


1.甲基化捕获测序数据QC结果


通过甲基化位点的甲基化值的密度曲线、样本的非监督聚类图和PCA图等,整体的展示项目中所有样本,在组间与组内的差异以及相互关系,不但能够对样本整体数据质量有一个直观的了解,同时还可以考察数据结果与项目设计是否吻合。


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数据QC图:A. 甲基化位点的甲基化值密度曲线图,将可以比较实验组与对照组间整体的甲基化分布是否有差异,也可以考察是否有个别样本的整体甲基化程度发生了改变。B.  PCA图,在二维或三维空间中以空间距离展示样本间相互关系的远近。对捕获测序370w位点进行降维处理,以2~3个主成分差异代替370w个探针的差异。C. 样本的非监督聚类聚类图,数据接近的样本,在关系树中位于更近的位置。D. 样本的相关性图,样本相关性热图用于展示样本之间的相关性,相关系数越接近1,表明样品之间甲基化模式的相似度越高。



2.甲基化捕获测序差异甲基化位点结果


使用methylkit(版本:v1.6.1)工具,得到methylKit可以直接读取的基因组水平甲基化扫描文件,对样品进行分组进较,并得到的差异显著位点(DMS),并对差异位点进行注释。


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差异甲基化位点图:A. 热图,用于查看组间样本的差异和组内样本的相似程度,可明显展示出组间样本差异情况。B.  火山图用于展示组间差异DMS的Δβ和显著程度,图中横坐标为Δβ值,纵坐标为P值或adj.P值的负对数。图中右上区域和左上区域分别代表hypermethylated和hypomethylated的点,且具有统计学差异的点。C、TSS上下游甲基化分布图,提取甲基化位点相关信息,分析转录起始位点TSS上下游10kb的组间甲基化差异,展示样本组间之间的整体差异。D. 差异位点基因组区域分布图,不同区域发生甲基化其调控基因表达的方式有所区别,统计不同功能区域DMS 的数量。



3.甲基化捕获测序差异甲基化区域结果


差异甲基化修饰区域(Differentially Methylated Region,DMR)指在基因组中差异甲基化位点经常会成簇出现,形成一段差异甲基化区域,其范围小至数百bp,大到Mb级别。这些区域在基因表达调控方面发挥重要作用。DMR在基因组上的分布存在多样性(启动子、外显子、内含子及基因间区等),因此它对基因表达调控的方式也是多样的。


使用eDMR(版本:0.6.4.1)工具,结合所有甲基化位点的p值筛选最合适的DMR区间长度使得该区域上差异甲基化位点(DMS)的综合p值达到显著的水平,从而得到甲基化区域(DMR)。


利用DMR所在的基因组位置与基因组结构注释信息,使用ChIPseeker(版本:1.18.0)软件对其进行功能区域注释,当DMR所在区域与特定基因功能元件有重叠时,将相应的基因挑选出来,称为DMR相关基因。


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差异甲基化区域图:A. 差异DNA甲基化区域的基因组分布简图,差异甲基化区域的基因组分布简图更加简洁的展示了差异DNA甲基化位点在各条染色体的分布状态。B.  差异甲基化区域细节展示图,差异甲基化区域所在染色体和染色体上的物理位置。C、火山图,火山图用于展示组间差异区域的Δβ和显著程度,图中横坐标为Δβ值,纵坐标为P值或adj.P值的负对数。图中右上区域和左上区域分别代表hypermethylated和hypomethylated的区域,且具有统计学差异的区域。D. 热图,热图用于查看组间样本的差异情况和组内样本相似程度。






五、甲基化与基因组或转录组共同分析


生命现象的背后有着复杂的遗传基础与精密的调控分子机制,基因组的DNA序列构建了遗传基础;甲基化修饰、组蛋白修饰和lncRNA的转录前调控,非编码RNA(包括miRNA, lncRNA与circRNA)的转录后调控,以及翻译后的蛋白修饰等组成了复杂而精密的调控过程;mRNA、蛋白的表达高低或修饰情况以及代谢物的丰度是以上过程为适应环境而共同作用的目的和结果。仅靠单一组学的分析只能在单个层面中得到信息,并不能从整体上理解疾病与生命过程发生的来龙去脉。在后基因组时代,科学研究会朝着更全面、更精细的方向发展,多组学研究以至系统生物学研究将是一个大趋势。


我们为多组学研究提供了整体解决方案,其中也包括数据分析的思路与结果展示的方法。多组学的分析可通过基因组-转录组、基因组-甲基化-转录组、甲基化-转录组等不同形势。



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甲基化多组学高级分析:A. 甲基化与表达谱相关性热图,此类型的图也可展示其他不同组学的相关性。B. 基因组、转录组与甲基化组变异通路图,可在同一张图上展示通路中的基因组、转录组与甲基化组等不同组学上的变异,以及多组学的变异对通路的影响。C. 关键基因的多组学相关性图,以相关性图的形式,同时展示关键基因在基因组、转录组与甲基化等多组学层面上的相关性,共变异或甲基化状态。


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