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普瑞文献 | 中科普瑞单细胞平台助力非酒精性脂肪性肝炎进展过程中巨噬细胞和肝窦内皮细胞亚群扩张的研究

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标题:Expansion of macrophage and liver sinusoidal endothelial cell subpopulations during non-alcoholic steatohepatitis progression

发表期刊:ISCIENCE(IF=6.107)

合作单位:上海市第一人民医院

研究背景与研究目的:肝非实质细胞(NPCs)在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的进展中起着关键作用。作者通过单细胞测序探索NPC的异质性,并确定导致NASH进展的NASH特异性亚群。

检测手段:BD scRNA_seq RNAseq  免疫荧光

实验对象:3高脂高糖饮食(HFD)小鼠肝脏 VS 3自由饮食取水(Chow)小鼠肝脏。

 

研究结论

1、健康和NASH小鼠转录异质性分析

建立高脂高果糖饮食(简称 HFD 组)小鼠模型。20 周后,HFD组的体重、肝脏重量和肝脏体积较喂食食物的组(简称食物组)显著增加(图1A)。HFD小鼠出现脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎性浸润和肝纤维化,与 NASH的病理表现一致(图 1B)。从HFD (n = 3)和 Chow (n = 3)小鼠中分离肝NPC,并进行 RNA-Seq 分析。在HFD,HFD 和 Chow 之间共发现 1,613 个差异表达基因,其中 830 个基因上调,783个基因下调,包括代表 NAMs (Trem2, Gpnmb)、 HSCs(Dcn,Colla 1)、ECs (Lyve1)、DC(FLT3)和NK细胞(Xc11)的基因(图1C)。这些结果表明,在NASH进展过程中,各种类型的NPC 可能受到影响。

 

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图1 健康和NASH小鼠转录异质性分析

 

为了研究不同类型的NPC及其亚群在 NASH发病机制中的确切作用,还对同一批接受RNA-Seq 处理的NPC 进行了 scRNA_seq 分析。从6只小鼠的肝脏中分离出48,272个细胞,成功测序,其中29,784个细胞来自HFD小鼠,18,488个细胞来自 Chow小鼠。根据细胞类型特异性标记基因,可将这些细胞分为 10 种不同的类型,包括ECs、T细胞、B细胞、NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、造血干细胞及其他主要由肝细胞和红细胞组成的细胞(图 1DF)。B细胞和ECs是HFD和Chow小鼠中最丰富的细胞类型,分别占NPCs 的28.0 33.6%和25.3 29.5%(图1G和S1B)。HSC的平均比例从 Chow 组的0.2%显著升高到HFD组的0.5%,NK细胞的平均比例从5.0%降低到3.5%(图1H)。作者还发现,HFD小鼠的ECs 和巨噬细胞比例高于 Chow 小鼠。此外,HFD 组的树突状细胞明显多于 Chow 组。这些发现进一步表明,NPC,尤其是HSC、DC、ECs、NK细胞和巨噬细胞的改变可能与 NASH的发生有关。

 

2、NASH肝脏巨噬细胞异质性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞扩增研究

scRNA_seq 数据显示,肝巨噬细胞由六个簇组成(簇7、12、19、21、23、25)。在这里作者使用小提琴图展示各个聚类中的的markergene(图2A),分析发现聚类21中的大多数细胞来自HFD,与Chow小鼠相比,在 HFD小鼠中观察到该亚群的显著扩增(图2B-C和s 2B)。聚类21,23是Itgad和Fcr15高表达,但不含Trem2和Gpnmb等NAMs 标记基因(图2A)。值得注意的是,几乎所有这些Itgadhi/Fcr15hi细胞均来自HFD小鼠,这表明它们可能是与NASH进展密切相关的独特巨噬细胞亚群(图2B-C)。

通过qPCR分析,在肝NPC 中验证了HFD小鼠中Trem2、Gpnmb、Itgad和Fcr15的上调,这进一步表明,在NASH进展期间,聚类21和23的亚群扩大(图2D)。拟时序分析显示,以Top2a和Mki67 高表达为特征的分裂细胞位于轨迹路径的起点。巨噬细胞通过以Itgadhi/Fcr15hi和Trem2hi/Gpnmbhi细胞为特征的中间状态,达到Timd4hi/Clec4fhi细胞状态(图2E-G)。

接下来,作者进行了免疫荧光和流式细胞术分析,以确认肝脏中存在Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞。与 scRNA_seq 的结果一致,作者发现在 NASH肝脏中,Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群显著扩增(2H)。此外,在F4/80+ CD11b+双阳性巨噬细胞中,HFD组的Fcr15+细胞比例明显高于Chow组(图2I)。作者的结果表明,除NAMs 外,小鼠肝脏中还出现了Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞亚群,两者在NASH进展期间均扩增。

 

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图2 NASH肝脏巨噬细胞异质性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞扩增研究

 

3、NASH肝脏ECs细胞异质性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs细胞扩增研究

为了进一步探索 NASH小鼠中 ECs 的异质性,作者将ECs重新聚类为 13 个亚群((图3A)。表现出D114/Msr高表达但Wnt2/Kit 低表达的ECs-1和ECs-8 被认为是门静脉周围ECs,而表现为Wnt2/Kit中高表达但D114/Msr1极低表达的ECs-0、ECs2、ECs-4和ECs- 10 可能属于中枢周围 ECs。与门静脉周围和中枢周围ECs 相比,ECs-3、ECs-5 和ECs-7的 D14/Msr1 和 Wnt2/Kit 表达中等,但Cxc110 表达独特,被视为 LSECs。如图3D 所示,HFD组LSECs 亚群ECs-3、ECs-7 比例升高,门静脉周围亚群 ECs-1、中枢周围亚群 ECs-2 比例显著降低。ECs-3 大量表达Egr1(可促进胆汁淤积性肝损伤小鼠的炎症),以及与细胞增殖密切相关的Plk2。ECs-7 以Isg15、Ifit1、Ifit2、Ifit3、Ifi44、Ifi47 等干扰素诱导基因高表达为特征,且Ly6a 也高表达。作者通过免疫荧光证实了HFD小鼠肝脏中Egrlhi 亚群和Ly6ahi亚群的扩增(图3E-G)。流式细胞术分析显示,Ly6a+ ECs约占HFD小鼠NPC的10%,而在 Chow 小鼠中仅占 5%左右(图3I)。这些结果表明,在NASH进展过程中,Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs亚群扩增。

 

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图3 NASH肝脏ECs细胞异质性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs细胞扩增研究

 

4、在NASH发展早期Egrlhi LSECs、Ly6ahiLSECs与Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞的扩增研究

HE染色,流式分析发现随着随着高脂肪高果糖饮食 8 周、16 周、32 周的延长,肝脏脂质蓄积、炎性浸润、纤维化逐渐加重,这两种改变在第 32 周时都显著增强。并且Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞与Egrlhi 、Ly6ahi LSECs数量与逐渐增加,相关基因分析也是如此。这些结果表明,Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞亚群、Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs出现在NASH早期,并在病理进程中发生急剧扩张,提示它们可能参与了NASH的加重。

 

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图4在NASH发展早期中Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs与Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞的扩增研究

 

5、NASH肝脏中增强的NPC细胞通讯研究

作者发现,与 Chow 组相比,HFD 组的大部分细胞间通讯都得到极大的增强(图6A-B)。在HFD小鼠中,HSC与多种细胞类型积极沟通,在HSC和ECs之间观察到最强的相互作用。此外,在 HFD,检测到 HSC 与巨噬细胞(包括KCs、MDM和分裂细胞)之间存在较强的相互作用,同时HSC自身内部的细胞间通讯也显薯增强,Itgad、Fcr15、Egr1、Plk2、Ly6a、Ifitl、Ifit3 和Isg15与Colla1的ISG 15呈正相关(图6C-E),表明在NASH进展过程中,HSC与Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs 、Ly6ahi LSECs之间可能存在密切的相互作用。总之,作者的结果表明,NASH肝中NPC之间的细胞间相互作用,尤其是HSC与ECs/巨噬细胞之间的相互作用增强。

 

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图5NASH肝脏中增强NPC细胞通讯研究

 

总结

作者的研究发现表明,在肝NPC 中,亚群的Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi  LSECs、Ly6ahi LSECs 在 NASH 早期积聚,其扩展与疾病严重程度密切相关,提示这些亚群可能参与了 NASH的进展。NASH 肝中NPC之间的细胞间相互作用增强,HSC与Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs之间发生密切相互作用,表明这些亚群可能有助于HSC的活化。作者的研究对 NASH进展中NPC的异质性提供了见解。在后续研究中,需要研究健康和患病肝脏中Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs的功能和意义。


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